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Contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la population Algérienne / Meriem ABDI 

Public ISBD Titre : Contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la population Algérienne Type de document : document électronique Auteurs : Meriem ABDI, Auteur Année de publication : 2014 Importance : 192 p. Accompagnement : CD Langues : Français (fre) Catégories : Biotechnologie :biologie moléculaire Mots-clés : Hémophilie A, F8, FVIII, anomalies moléculaires, PCR Long Rang, PCR triplex, Séquençage, MLPA, inhibiteurs, étude in silico Heamophilia A, F8, FVIII, mutations, PCR Long Rang, triplex PCR, DNA Sequencing, MLPA, inhibitor, in silico. اهليموفيليا )أ( ،PCR، الطفرات،FVIII ،F Résumé : Cette thèse représente une contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la population Algérienne. Nous avons eu comme premier objectif de caractériser les anomalies moléculaires du gène F8 responsables l’hémophilie A dans un échantillon constitué de 27 patients appartenant à 21 familles par l’utilisation de différentes méthodes de biologie moléculaire (PCR Long Rang, PCR triplex, Séquençage et MLPA). L’analyse moléculaire du gène F8 a permis l’identification des anomalies moléculaires responsables de l’hémophilie A chez 18 familles. Ces mutations sont de cinq types : la micro-inversion de l’intron 22, la micro-inversion de l’intron 1, deux mutations nonsenses (c.322A>T, c.5953C>T), une mutation au niveau d’un site donneur d’épissage (c.5219+1G>T) et trois mutation faux-sens (c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A). A l’exception de la micro-inversion de l’intron 22 qui est récurrente (57,89%), les autres types de mutations sont spécifiques à chaque famille. Deux nouvelles mutations (c.5219+1G>T, c.2189G>A) ont été rapportées dans cette étude. Ces deux mutations n’ont jamais été décrites dans d’autres populations ; elles sont spécifiques à la population Algérienne. Dans la deuxième partie de cette étude, nous nous sommes intéressés à l’étude de la prédisposition génétique au développement des inhibiteurs. Ainsi, une corrélation entre le statut développement des inhibiteurs et le type de mutation du gène F8 a été réalisée. Aucune association n’a été identifiée entre le type de mutation du gène F8 et le développement des inhibiteurs dans cet échantillon. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons eu comme objectif de contribuer à la compréhension des mécanises moléculaires à l’origine du déficit de la protéine FVIII. Ainsi, les effets délétères des nouvelles mutations identifiées dans la première partie de cette étude et de la mutation c.200 A>C (citée dans les bases de données et non étudiée) ont été prédits en utilisant une combinaison de logiciels d’étude in silico et de modélisation moléculaire en 3D. La mutation c.5219+1G>T a été prédite comme responsable d’un saut de l’exon 14. D’autre part, la mutation c.2189G>A a été prédite comme responsable de la rupture d’un pont disulfure ayant comme effet la dissociation du domaine A2 responsable d’une déstabilisation du FVIII. La mutation c.200A>C a été prédite comme délétère au niveau de la structure ainsi que la fonction du FVIII. Les différences de propriétés physico-chimiques entre les deux aa sont responsables de la perte des interactions moléculaires au sein de la protéine FVIII. L’ensemble des résultats obtenus, plaçant les patients hémophiles au centre de cette thématique de recherche, pourra contribuer à moyen terme à installer un programme « conseil génétique » pour les familles à risque et à améliorer la prise en charge des patients. A long terme ces résultats pourront contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de cette pathologie permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques This thesis represents a contribution to the molecular analysis of hemophilia A in the Algerian population. The aim of the first part of the study was to detect the F8 gene alterations in 27 patients belonging to 21 Algerian families using several biomolecular methods (PCR LR, triplex PCR, DNA sequencing and MLPA). Molecular analysis of the F8 gene led to the identification of molecular abnormalities responsible for hemophilia A in 18 families. These mutations include intron 22 inversion, intron 1 inversion, two nonsense mutations (c.322A>T, c.5953C>T), one splice site mutation (c.5219+1G>T), and three missense mutations (c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A). Except for intron 22 inversion that is recurrent (57.89%), the other identified mutations are specific to each family. Two novel mutations (c.5219 +1 G> T, c.2189G > A) were reported in this study. Both mutations have never been described in other populations; they seem to be specific to the Algerian population. In the second part of this study, we aimed to analyze the relationship between F8 gene mutation types and inhibitor development. We showed that there was any association between F8 gene mutations and the inhibitor development in our study-group. However, these findings should be confirmed in a larger group of patients. Furthermore, deleterious effects of mutations on FVIII protein were assayed using in silico tools and 3D molecular modeling. Thus, the deleterious effects of novel mutations identified in the first part of this study and the mutation c.200 A>C (just cited in databases but not studied) were predicted. The donor splice site mutation (c.5219+1G>T) was predicted to be responsible of exon 14 skipping. Moreover, the novel missense mutation (c.2189G>A) was predicted to be responsible of the breakdown of a disulfide bridge (Cys630-Cys711). Disruption of this disulfide bridge leads to an inactivation of the FVIII by destabilization of the A2 domain. The mutation c.200A > C was predicted to be deleterious to the FVIII structure and function. Differences in physicochemical properties between the two aa are responsible for the loss of molecular interactions within the FVIII protein. These overall results, placing patients with hemophilia A in the center of this area of research, can help in the medium term to install a genetic counseling program for affected families and to improve a better medical care of hemophiliac patient. In the long term, these results will contribute to a better understanding of the molecular causes of this disease and to fostering newer therapeutic strategies ان هذه األطروحة يه عبارة عن مساهمة يف دراسة وراثية جزيئية ملرض اهليموفيليا )أ( يف اجلزائر. كأول هدف هلذه األطروحة تمثل يف توصيف التشوهات اجلزيئية يف اجلنيF8 املسؤولة عن اهليموفيليا )أ( يف عينة تتكون من 72 مريض ينتمون ل72 أرسة عن طريق استخدام خمتلف تقنيات ابليولوجيا اجلزيئية et Séquençage,triplex PCR, Rang Long PCR( (MLPA .لقد سمح اتلحليل اجلزييئ بتحديد مخسة أنواع من الطفرات املسؤولة عن اهليموفيليا )أ( يف 21 أرسة انقالب جزيئ يف اإلنرتون 77 ،انقالب جزيئ يف إنرتون 2 ،طفرتان هرائيتان (T>5953C.c, T>322A.c , (طفرة يف املوقع املانح طفرة باستثناء) c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A) مغلطة طفرات وثالثة) c.5219 + 1G> T) للربط انقالب جزيئ يف اإلنرتون 77 كثرية االنتشار )15.92 )٪فالطفرات األخرى يه حمددة للك أرسة. يف هذه ادلراسة لقد تم اكتشاف طفرتني جديدتني (A>2189G.c, T>1G+5219.c (لم يسبق وصفهما يف الشعوب األخرى و باتلايل فهما ختصان الشعب اجلزائري. يف اجلزء اثلاين هلذه ادلراسة، انصب اهتمامنا ىلع دراسة االستعداد الورايث النتاج املثبطات, وكذااالرتباط بني حالة االنتاج و نوع الطفرة اجلينيةF8. انلتائج أسفرت عن عدم وجود أي ارتباط بني نوع الطفرات و انتاج املثبطات. يف اجلزء اثلالث و األخري هلذه ادلراسة سعينا لفهم األيلات اجلزيئية اليت تسبب العجز يف الربوتني FVIII.ذللك تم دراسة اآلثار الضارة للطفرتني اجلديدتني و طفرةC> A 200.C( مقتبسة من قاعدة ابليانات و غري مدروسة( عن طريق استخدام برجميات لدلراسة يف السيليكون و انلمذجة اجلزيئية ثالثية األبعاد. ان الطفرة T>1G+5219.c مسؤولة عن ختطي اكسون 21 يف حني أن الطفرة A>2189G.c مسؤولة عن غياب جرس كربييت يف الربوتني املسؤول عن احنالل امليدان A2 مما يؤدي اىل زعزعة استقرارالربوتني FVIII . الطفرة C>200A.c أظهرت أتار سلبية ىلع بنية و وظيفة الربوتني FVIII حبيث االختالفات يف اخلصائص الفزييائية والكيميائية للحمضني االمينني )لزيين و ثريونني( تؤدي اىل فقدان روابط جزيئية ىلع مستوى الربوتني FVIII .انلتائج املتحصل عليها يف هذا ابلحث تساعد ىلع ىلع املدى املتوسط بوضع برنامج "االستشارة الوراثية" لألرس املعرضة للخطر و حتسني راعية املرىض . أما ىلع املدى الطويل فهذه انلتائج ستساهم يف فهم أفضل لآليلات اجلزيئية األصلية هلذا املرض مما يسمح بوضع اسرتاتيجيات عالجية جديدة. Directeur de thèse : ZEMANI-FODIL ,Faouzia Contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la population Algérienne [document électronique] / Meriem ABDI, Auteur . - 2014 . - 192 p. + CD. Langues : Français (fre) Catégories : Biotechnologie :biologie moléculaire Mots-clés : Hémophilie A, F8, FVIII, anomalies moléculaires, PCR Long Rang, PCR triplex, Séquençage, MLPA, inhibiteurs, étude in silico Heamophilia A, F8, FVIII, mutations, PCR Long Rang, triplex PCR, DNA Sequencing, MLPA, inhibitor, in silico. اهليموفيليا )أ( ،PCR، الطفرات،FVIII ،F Résumé : Cette thèse représente une contribution à l’étude moléculaire de l’hémophilie A dans la population Algérienne. Nous avons eu comme premier objectif de caractériser les anomalies moléculaires du gène F8 responsables l’hémophilie A dans un échantillon constitué de 27 patients appartenant à 21 familles par l’utilisation de différentes méthodes de biologie moléculaire (PCR Long Rang, PCR triplex, Séquençage et MLPA). L’analyse moléculaire du gène F8 a permis l’identification des anomalies moléculaires responsables de l’hémophilie A chez 18 familles. Ces mutations sont de cinq types : la micro-inversion de l’intron 22, la micro-inversion de l’intron 1, deux mutations nonsenses (c.322A>T, c.5953C>T), une mutation au niveau d’un site donneur d’épissage (c.5219+1G>T) et trois mutation faux-sens (c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A). A l’exception de la micro-inversion de l’intron 22 qui est récurrente (57,89%), les autres types de mutations sont spécifiques à chaque famille. Deux nouvelles mutations (c.5219+1G>T, c.2189G>A) ont été rapportées dans cette étude. Ces deux mutations n’ont jamais été décrites dans d’autres populations ; elles sont spécifiques à la population Algérienne. Dans la deuxième partie de cette étude, nous nous sommes intéressés à l’étude de la prédisposition génétique au développement des inhibiteurs. Ainsi, une corrélation entre le statut développement des inhibiteurs et le type de mutation du gène F8 a été réalisée. Aucune association n’a été identifiée entre le type de mutation du gène F8 et le développement des inhibiteurs dans cet échantillon. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons eu comme objectif de contribuer à la compréhension des mécanises moléculaires à l’origine du déficit de la protéine FVIII. Ainsi, les effets délétères des nouvelles mutations identifiées dans la première partie de cette étude et de la mutation c.200 A>C (citée dans les bases de données et non étudiée) ont été prédits en utilisant une combinaison de logiciels d’étude in silico et de modélisation moléculaire en 3D. La mutation c.5219+1G>T a été prédite comme responsable d’un saut de l’exon 14. D’autre part, la mutation c.2189G>A a été prédite comme responsable de la rupture d’un pont disulfure ayant comme effet la dissociation du domaine A2 responsable d’une déstabilisation du FVIII. La mutation c.200A>C a été prédite comme délétère au niveau de la structure ainsi que la fonction du FVIII. Les différences de propriétés physico-chimiques entre les deux aa sont responsables de la perte des interactions moléculaires au sein de la protéine FVIII. L’ensemble des résultats obtenus, plaçant les patients hémophiles au centre de cette thématique de recherche, pourra contribuer à moyen terme à installer un programme « conseil génétique » pour les familles à risque et à améliorer la prise en charge des patients. A long terme ces résultats pourront contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de cette pathologie permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques This thesis represents a contribution to the molecular analysis of hemophilia A in the Algerian population. The aim of the first part of the study was to detect the F8 gene alterations in 27 patients belonging to 21 Algerian families using several biomolecular methods (PCR LR, triplex PCR, DNA sequencing and MLPA). Molecular analysis of the F8 gene led to the identification of molecular abnormalities responsible for hemophilia A in 18 families. These mutations include intron 22 inversion, intron 1 inversion, two nonsense mutations (c.322A>T, c.5953C>T), one splice site mutation (c.5219+1G>T), and three missense mutations (c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A). Except for intron 22 inversion that is recurrent (57.89%), the other identified mutations are specific to each family. Two novel mutations (c.5219 +1 G> T, c.2189G > A) were reported in this study. Both mutations have never been described in other populations; they seem to be specific to the Algerian population. In the second part of this study, we aimed to analyze the relationship between F8 gene mutation types and inhibitor development. We showed that there was any association between F8 gene mutations and the inhibitor development in our study-group. However, these findings should be confirmed in a larger group of patients. Furthermore, deleterious effects of mutations on FVIII protein were assayed using in silico tools and 3D molecular modeling. Thus, the deleterious effects of novel mutations identified in the first part of this study and the mutation c.200 A>C (just cited in databases but not studied) were predicted. The donor splice site mutation (c.5219+1G>T) was predicted to be responsible of exon 14 skipping. Moreover, the novel missense mutation (c.2189G>A) was predicted to be responsible of the breakdown of a disulfide bridge (Cys630-Cys711). Disruption of this disulfide bridge leads to an inactivation of the FVIII by destabilization of the A2 domain. The mutation c.200A > C was predicted to be deleterious to the FVIII structure and function. Differences in physicochemical properties between the two aa are responsible for the loss of molecular interactions within the FVIII protein. These overall results, placing patients with hemophilia A in the center of this area of research, can help in the medium term to install a genetic counseling program for affected families and to improve a better medical care of hemophiliac patient. In the long term, these results will contribute to a better understanding of the molecular causes of this disease and to fostering newer therapeutic strategies ان هذه األطروحة يه عبارة عن مساهمة يف دراسة وراثية جزيئية ملرض اهليموفيليا )أ( يف اجلزائر. كأول هدف هلذه األطروحة تمثل يف توصيف التشوهات اجلزيئية يف اجلنيF8 املسؤولة عن اهليموفيليا )أ( يف عينة تتكون من 72 مريض ينتمون ل72 أرسة عن طريق استخدام خمتلف تقنيات ابليولوجيا اجلزيئية et Séquençage,triplex PCR, Rang Long PCR( (MLPA .لقد سمح اتلحليل اجلزييئ بتحديد مخسة أنواع من الطفرات املسؤولة عن اهليموفيليا )أ( يف 21 أرسة انقالب جزيئ يف اإلنرتون 77 ،انقالب جزيئ يف إنرتون 2 ،طفرتان هرائيتان (T>5953C.c, T>322A.c , (طفرة يف املوقع املانح طفرة باستثناء) c.200A>C, c.2189G>A, c.6545G>A) مغلطة طفرات وثالثة) c.5219 + 1G> T) للربط انقالب جزيئ يف اإلنرتون 77 كثرية االنتشار )15.92 )٪فالطفرات األخرى يه حمددة للك أرسة. يف هذه ادلراسة لقد تم اكتشاف طفرتني جديدتني (A>2189G.c, T>1G+5219.c (لم يسبق وصفهما يف الشعوب األخرى و باتلايل فهما ختصان الشعب اجلزائري. يف اجلزء اثلاين هلذه ادلراسة، انصب اهتمامنا ىلع دراسة االستعداد الورايث النتاج املثبطات, وكذااالرتباط بني حالة االنتاج و نوع الطفرة اجلينيةF8. انلتائج أسفرت عن عدم وجود أي ارتباط بني نوع الطفرات و انتاج املثبطات. يف اجلزء اثلالث و األخري هلذه ادلراسة سعينا لفهم األيلات اجلزيئية اليت تسبب العجز يف الربوتني FVIII.ذللك تم دراسة اآلثار الضارة للطفرتني اجلديدتني و طفرةC> A 200.C( مقتبسة من قاعدة ابليانات و غري مدروسة( عن طريق استخدام برجميات لدلراسة يف السيليكون و انلمذجة اجلزيئية ثالثية األبعاد. ان الطفرة T>1G+5219.c مسؤولة عن ختطي اكسون 21 يف حني أن الطفرة A>2189G.c مسؤولة عن غياب جرس كربييت يف الربوتني املسؤول عن احنالل امليدان A2 مما يؤدي اىل زعزعة استقرارالربوتني FVIII . الطفرة C>200A.c أظهرت أتار سلبية ىلع بنية و وظيفة الربوتني FVIII حبيث االختالفات يف اخلصائص الفزييائية والكيميائية للحمضني االمينني )لزيين و ثريونني( تؤدي اىل فقدان روابط جزيئية ىلع مستوى الربوتني FVIII .انلتائج املتحصل عليها يف هذا ابلحث تساعد ىلع ىلع املدى املتوسط بوضع برنامج "االستشارة الوراثية" لألرس املعرضة للخطر و حتسني راعية املرىض . أما ىلع املدى الطويل فهذه انلتائج ستساهم يف فهم أفضل لآليلات اجلزيئية األصلية هلذا املرض مما يسمح بوضع اسرتاتيجيات عالجية جديدة. Directeur de thèse : ZEMANI-FODIL ,Faouzia

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Code-barres	Cote	Support	Localisation	Section	Disponibilité
4651	02-34-58	Version numérique et papier	Bibliothèque USTOMB	Thèse de Doctorat	Exclu du prêt

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